制備色譜是指采用色譜技術(shù)制備純物質(zhì)，即分離、收集一種或多種色譜純物質(zhì)。制備色譜中的“制備”這一概念指獲得足夠量的單一化合物，以滿足研究和其它用途。制備色譜的出現(xiàn)，使色譜技術(shù)與經(jīng)濟(jì)利益建立了聯(lián)系。制備量大小和成本高低是制備色譜的兩個重要指標(biāo)。其中，氣相制備色譜主要用于石油化工產(chǎn)品和揮發(fā)性天然產(chǎn)物的色譜純樣品制備。

首先，小析姐必須帶你了解制備色譜到底是什么。

（1）分析色譜的目的：

分析出混合物中一個（或者幾個）純物質(zhì)的含量。制備色譜的目的，是從混合物中得到純物質(zhì)。為了加快分離的時間與提高分離的效率，制備色譜的的進(jìn)樣品量很大，導(dǎo)致制備色譜柱子的分離負(fù)荷的相應(yīng)加大，也就必須加大色譜柱填料，增大制備色譜的直徑和長度，使用的相對多的流動相。然而，當(dāng)色譜柱上樣品負(fù)載加大的時候，往往導(dǎo)致柱效急劇下降而得不到純的產(chǎn)品。制備色譜，要解決容量與柱子效果之間的矛盾，對重現(xiàn)性也要考慮。從經(jīng)濟(jì)上來說，制備色譜要爭取少用填料，少用溶劑，要盡可能多的得到產(chǎn)品。

（2）樣品的前處理：

制備色譜柱子由于處理的樣品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前處理就顯得非常必要。萃取、過濾、結(jié)晶、固相萃取等簡單的分離方法，如果用得上，而且還不是很麻煩，就要盡可能多的采用以去掉雜質(zhì)。

（3）制備色譜柱的材質(zhì)及其特點：

下面介紹一下，制備色譜柱常用的材質(zhì)及其特點：

各種規(guī)格的玻璃柱子在實驗室里頭很容易得到，而且價格低廉，但玻璃柱子致命的弱點是它能承受的壓力很小，且非常容易破碎。當(dāng)由于壓力太小而導(dǎo)致流動相流速很慢的時候，高位液面或加高壓空氣（或者氮氣）的采用是一個簡單的解決辦法。在底下加真空，也能在一定程度上解決這個問題。

不銹鋼柱子具有良好的耐腐蝕、抗壓力性能，但其價格相對很貴。如果，只有很小的分離任務(wù)且經(jīng)費也允許，市面上直徑為1cm的小型制備柱就是首選。

有機玻璃柱子也能抗壓力耐腐蝕，相對不銹鋼柱子而言，它是半透明的，可以看到液體的運行狀態(tài)，對有色的物質(zhì)其特點就更為突出。

（4）固定相的選擇：

硅膠、鍵合固定相（如，C18）、離子交換樹脂、聚酰胺、氧化鋁、凝膠等都可以作為色譜柱的填料。有不少文獻(xiàn)報道，對填料可以進(jìn)行一下處理提高了分離效果，如，對硅膠進(jìn)行的硝酸銀（或緩沖液）處理。

（5）裝柱方法的選擇：

根據(jù)固定相顆粒度和柱子的尺寸，采用不同的裝柱方法，往往裝填越好分離效果越好。裝柱效果跟填料的顆粒度關(guān)系很大，顆粒度的減少會導(dǎo)致裝柱的難度。一般來說，顆粒直徑小于20～30μm的固定相采用濕法裝填。所謂“敲擊-裝填”技術(shù)適用于顆粒直徑大于25μm的固定相。濕法的目的是迫使相對稀松的固定相懸漿以高速裝入色譜柱子，從而減少空隙的形成。然而，當(dāng)柱直徑大于20mm，所加壓力為30～40bar時，高壓懸漿裝填技術(shù)就變得十分復(fù)雜。為將小顆粒固定相裝入更大得制備型色譜柱，可采用柱長壓縮技術(shù)。這種方法，先將固定相懸漿（或偶爾是干填充物）裝入柱中加壓，利用物理方法將其壓緊。壓緊的方法有兩種：徑向壓縮和軸向壓縮。濕法裝柱需要一定的設(shè)備，在柱子填完后，應(yīng)用有柱效的測量，對柱效低的柱子應(yīng)該重填。

（6）流動相的選擇：

除了和分析色譜同樣的考慮外，在選用流動相時，要考慮色譜分離后面加有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等二次分離操作。一般來說，不宜采用高毒性溶劑，對多元溶劑要盡可能的少用。如果產(chǎn)品中含有大量溶劑，溶劑的純度也要考慮在其中。

（7）加樣的方法：

可以采用以下方法之一進(jìn)樣。用注射器進(jìn)樣-用旋轉(zhuǎn)閥進(jìn)樣-通過六通閥進(jìn)樣-通過主泵進(jìn)樣-通過輔泵進(jìn)樣-固體上樣。。。

（8）泵的選用：

生產(chǎn)制備色譜泵的廠商很多。根據(jù)有無脈沖、能承受的最大壓力、控制的精度、售后服務(wù)等來選擇泵。

（9）檢測器的選用：

一般的分析池的最大允許流速僅為5mL/min或者10mL/min，而專門的制備池最大允許流速可為150mL/min。有時，采用旁路分離管，將少量流體導(dǎo)入分析池進(jìn)行檢測，是一個不錯的辦法，但其濃度的誤差會相對較大。

（10）組分保留時間的估計：

用分析柱子在同等色譜條件下（同樣的固定相和流動相）測定保留時間后，按照單一組分的線流速（不是體積流速）一定，通過計算可以知道組分的大致保留時間區(qū)域。分析譜圖的峰形狀，對確定保留時間也有很大的參考價值。

（11）產(chǎn)品的收集：

手工餾分收集費時費力，自動餾分收集器有很大的方便。許多實驗室和工廠都采用了餾分收集器。

（12）超載、邊緣切割、中心切割、放大技術(shù)與非線性效用：

在制備色譜中，因為沒有必要達(dá)到分析色譜那樣的分離度，可以在一定范圍內(nèi)大大加大進(jìn)樣的濃度和體積。在做分離的時候，也有一些分析色譜的時候，不能用到的技巧。因為篇幅關(guān)系，不在這里敘述。

（13）柱轉(zhuǎn)換技術(shù)：

通過接頭或者閥門，實現(xiàn)柱子的簡單延長，或者比較方便地實現(xiàn)對其中一個（或幾個）組分的精制。

（14）比較新的制備色譜技術(shù)：

模擬移動床可以連續(xù)進(jìn)樣，并可以利用邊緣切割效用，而且采用了柱切換技術(shù)，能更好的利用溶劑和填料，已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。其理論和技術(shù)也日益完善。

迎頭色譜、超臨界流體色譜、逆流色譜環(huán)形色譜、氣相制備色譜等在科研和工業(yè)生產(chǎn)中也得到了應(yīng)用。

網(wǎng)友問答：

1. 問：我想購買waters600用于分析和制備，對于其配備有什么好的建議?

答：可以配一個PDA，另外加一個示差折光410，另外買幾根制備柱就可以了。

waters600的流速最大為20mL/min，一般可以配20mmID的制備柱，一次分離10～100mg的樣品，如果樣品量更大，可以通過配件擴展到45mL/min，使用30mmID的制備柱。另外為了保證餾分收集的準(zhǔn)確性，最好配上FractionII 餾分收集器。如果樣品數(shù)量很大，可以配2767 sample manager和ZQMS, 同時做自動進(jìn)樣并通過MS或UV信號自動收集餾分。這樣可以過夜自動運行。最大通量每天可以處理100～200個樣品。

2. 問：如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？

制備色譜柱為ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson餾分收集器，色譜儀為Agilent1100或LC-6A。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進(jìn)行定性分析。如何設(shè)定色譜條件，如，流量、進(jìn)樣量、樣品的濃度、切割點的設(shè)置、是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除。

（主峰后有二個雜質(zhì)靠得很近。）

答：

1.制備用的流動相最好等級高一點，否則流動相中的雜質(zhì)會影響LC-MS分析。

2.使用餾分收集器時，延遲體積一定要計算精確，檢測器的響應(yīng)時間設(shè)到最小，否則都會影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min，9.4mm制備柱用1*（9.4/4.6）2,大約為4mL/min。進(jìn)樣量設(shè)到幾個mg應(yīng)該基本沒有過載。進(jìn)樣樣品濃度越高越好。假如進(jìn)樣10mg，理論計算0.05%的雜質(zhì)大約只有5μg，顯然濃度太低，最好是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。

3.問：我想用HPLC分離一個簡單多肽，我應(yīng)該選用什么樣的流動相，還有他的梯度，還有選用什么樣的柱子?

答：

RP-HPLC，C18柱可以制備很少量的肽。如果用RP-HPLC，首先應(yīng)該用同類型的分析柱子分析一下多肽含多少雜質(zhì)，設(shè)置緩緩的梯度的分離樣品，在根據(jù)分析柱子跑出的峰形，逐漸放大純化的方法。

4. 問：TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)pH的作用呢？TFA的濃度越高基線的漂移越厲害，那是不是說它的濃度在緩沖液pH允許的情況下越低越好呢？

答：

（1）TFA起到類似離子對的作用，一般濃度在0.05～0.1%，過高的濃度，會使溶液偏酸，長時間使用可能影響柱子壽命。

（2）同時TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時0.1%TFA分離不好的話。可以考慮加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時沖洗色譜柱。

（3）走梯度時，因為走成基線漂移，但對制備的影響不大。

5. 問：樣品如果溶解度太低如何上制備HPLC？

答：

（1）了解一下樣品的性質(zhì),根據(jù)其酸堿性,極性等性質(zhì)，通過調(diào)節(jié)溶劑的pH值等,以達(dá)到較好的溶解度。

（2）樣品可能某種晶型難溶，這樣可以加入其他溶劑（如，丙酮等）以助溶。

（3）不是一定要用流動相來溶解樣品，對溶解度差的樣品，可以選擇甲醇，THF或DMSO等溶解樣品。特別是DMSO，對一般的化合物溶解度都很好。并且在反相柱上不保留，不會造成干擾。而且DMSO的洗脫能力很弱，一般不會影響峰型。

（4）可以固體上樣。

6. 問：多肽的分離制備,如何上量？如何增大分離度?

答：

反相HPLC應(yīng)當(dāng)是很好的分離小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流動相，看保留如何，若無保留，建議改用其他色譜方法進(jìn)行分離。

關(guān)于多肽的分離，首先要知道它的分子量大小，然后選擇不同類型的填料，如孔徑的大小。我們先在分析柱（4.6mm內(nèi)徑）上做一下實驗,找到最大的分離度,這一過程的難度是最大的,要不斷地改變流動相和固定相,然后再線性或非線性放大到制備,放大的倍數(shù)按分析柱的實驗結(jié)果。分離后可以通過冷凍干燥得到固體。

還可以考慮離子交換來分l離

7.問：做柱層析時（國產(chǎn)大孔吸附樹脂），怎么才能把洗脫液中的樹脂殘留物處理干凈？

答：

大孔吸附樹脂在上使用前，一般需要進(jìn)行處理，方法包括用色譜純的甲醇或乙睛洗到?jīng)]有吸收；或樹脂用乙醇浸泡2天，丙酮浸泡2天，然后用常規(guī)的酸，堿洗。再用丙酮回流二小時就可以用了。

8.問：由分析型液相轉(zhuǎn)為制備型液相，其色譜系統(tǒng)需作多大調(diào)整？是否可以按照柱體積折算只改變流速？其上樣量多大為宜？

答：

(1)泵要換，流量要加大，壓力可不變或減少；流通池要換體積更大的。

（2）整個系統(tǒng)的管路要更換更粗的，否則壓力太大，而且特別容易發(fā)生堵塞。對流通池后的管路，最好增加反壓調(diào)節(jié)器，否則管路太短的話，反壓小會導(dǎo)致流通池氣泡，管路長的話會導(dǎo)致峰展寬。

（3）檢測器的響應(yīng)時間和峰寬要設(shè)置合適，否則會導(dǎo)致收集時延遲體積的計算不準(zhǔn)

（4）上樣量主要根據(jù)柱子的大小、樣品的濃度、制備是否根據(jù)分析條件放大（例如，制備柱是否還用分析用填料）；一般上樣量與柱子直徑的平方以及長度成正比。

9. 問：流動相中含有鹽時，收集液該如何除鹽？選用揮發(fā)性酸，堿或鹽（如，醋酸銨）是否會在揮干溶劑或凍干過程中直接除去？

答：

一般可以采用離子吸附的辦法去掉（可以參考離子吸附有關(guān)技術(shù)），但也是稍微麻煩的事情，最好，不加加酸堿鹽，如果要加的話最好，要加揮發(fā)性的或者對產(chǎn)品或者檢測沒有干擾的。

可用G25脫鹽，它是安馬西亞出的一種葡聚糖凝膠。交聯(lián)度大孔徑小,對小分子的無機鹽保留較大,而對分子量較大的有機物沒有保留從而可以將鹽份脫除。另外采用揮發(fā)性的酸，堿時，一般會在干燥過程中直接除去，但如果樣品也有酸堿性，可能會與這些揮發(fā)性酸堿形成一定比例的鹽。

10. 問：制備型柱子柱壓上升，柱效下降，怎么辦？

答：

對高價值的制備柱來講，延長柱子壽命是很重要的。一般要注意保護(hù)柱子，一般來說，制備柱子一般需要保護(hù)柱配套。

下面是可能堵塞柱子的原因：

（1）如果您所分離的樣品中雜質(zhì)較多而您在上樣前沒有經(jīng)過過濾（0.45微米），一些顆粒性雜質(zhì)會積聚在柱頭造成柱壓升高。

（2）也有可能是因為您所使用的流動向中含有緩沖鹽的原因，結(jié)晶或發(fā)生化學(xué)變化而堵塞。可以把柱子沖一沖。

（3）流動相是否符合液相色譜的要求？是否過濾處理？

柱子再生處理辦法如下：

（1）依次用水，甲醇，四氫呋喃，氯仿，甲醇來沖洗柱子，每種溶劑5～10個柱體積。

（2）如果效果不明顯，將柱子按以上順序反沖，一般將大大降低柱子效果，不到不要沒有辦法才采用。

（3）如果效果還是不好，就需要打開色譜柱，超聲波清洗篩片（這樣也會使柱子效果下降）。必要時挖掉色譜柱內(nèi)受污染部位，填入新的填料，還可用3個月。（填的時候小心，別重新污染柱子）

11. 問：制備柱跑干了影響柱效嗎?

答：

如果時間不長的話，可以用流動相多沖幾個小時，柱效不一定變化很大。如果時間太久，柱效一定變低，具體造成影響有多大，要靠柱效測定來確定，而不是干柱時間的長短。如果跑干了，對于PUMP的影響可能還大些，所以最好先把管路中的空氣抽走再說。

一般說來，制備柱子跑干，屬于操作失當(dāng)。柱子閑置不用時，最好沖入甲醇或其他有機溶劑，一定要把兩頭堵住密封，這樣保留的時間會較長。

12. 問：分析HPLC如何放大到制備型HPLC?

答：

在分析液相中色譜柱的典型進(jìn)樣量是微克級，甚至更低。樣品量和固定相之比有的甚至小于1:10000。進(jìn)樣體積一般來說都大大小于色譜柱體積（小于1:100）。在這種條件下，會達(dá)到很好的分離效果，峰形尖銳并且很對稱。

分析系統(tǒng)線形放大到制備型HPLC意味著使用直徑更大的制備柱、更高的流速和根據(jù)色譜柱的長度增加進(jìn)樣量并保持樣品濃度不變。峰形仍會保持尖銳而對稱。這種方法需要大型的色譜柱和大量的溶劑來分離較少的樣品，但這種方法從經(jīng)濟(jì)上一般不合適。

在制備液相中，最大的區(qū)別就是超量進(jìn)樣。制備的分離峰形一般不可能仍會保持尖銳而對稱，分析和制備是不同的概念。制備的首要概念是在達(dá)到純化的基礎(chǔ)上，降低成本，加快時間（提高效率）。一般說來，純化的成本要高于生產(chǎn)粗產(chǎn)品的成本，所以，可以加大上樣量，甚至過載，出現(xiàn)平頭峰，而收集只集中在峰的一小部分，以來保證純度，主要為了節(jié)省流動相和提高設(shè)備利用率。

13. 問：制備純化蛋白、多肽，耗用流動相驚人，請問這些用過的流動相（乙腈，甲醇）可以重蒸使用嗎？

答：

流動相用一般減壓方法重蒸后，往往會形成有機溶劑和水會共沸，另外，由于減壓蒸餾屬于單次平衡，往往得不到100%純度的溶劑，這會使溶劑的配置有一定困難，從而使色譜的重現(xiàn)性和分離度會發(fā)生一定的變化。如果要求不是很高的話，一般可以分析重蒸后餾分中的各組分含量，計算后再使用。

要通過重蒸得到純物質(zhì)是極其困難的，必須采用精餾塔多級蒸發(fā)，單就設(shè)備投資和能耗來講，實驗室規(guī)模或生產(chǎn)規(guī)模的廢液回收處理已經(jīng)是得不償失。其實，我們沒有必要得到純的物質(zhì)。

14. 問：反相色譜分離純化后，怎樣除去流動相產(chǎn)品中的TFA和乙腈或其他雜質(zhì)？

答：

TFA是反相色譜分離中常用的添加劑。可以用凍干的辦法去除，國外許多文獻(xiàn)是這樣報道的。還可以試試離子交換、凝膠層析、甚至透析和超濾，其中，離子交換層析效果比較好，還可以起到濃縮樣品的作用。

首先，凍干的辦法應(yīng)該可以幾乎徹底地除去TFA和乙腈，藥物實驗前最好先檢測一下凍干品中的殘留量，只要不超過允許范圍，這種辦法是最最簡單、有效的。

其次，如果你的藥物的分裝量不大的話(<100ug)，建議你用離子交換層析，最好裝一個小一點兒的柱子，讓含鹽洗脫峰的蛋白濃度達(dá)10mg/mL以上，稀釋后完全符合試驗要求。如果用分子篩，考慮稀釋，最好也先過一個離子交換。此外可以試試疏水層析。如果產(chǎn)品是堿的話，可能會形成TFA鹽，這樣通過上述方法就無法除去。一般可以用堿水洗，然后將產(chǎn)品萃取出來。或者在里面加入一定量的鹽酸，再干燥后形成鹽酸鹽。

15. 問：同一種填料的分析柱、制備柱按線形放大公式套，分離度會不會變化？

答：

一般會有一定的變化，原因有以下幾點：

（1）制備柱的裝填是否均勻，如不均勻則可能產(chǎn)生渦流擴散使各個組分的經(jīng)過通道的直徑不同、阻力不一樣，停留時間不同，色譜峰可能變寬。

（2）如果樣品在流動相中溶解度小，在制備色譜上會有不同的峰展寬。

（3）如果樣品在分析柱上有展寬或拖尾的現(xiàn)象，放大到制備柱上后峰的展寬和拖尾經(jīng)常會非常嚴(yán)重，導(dǎo)致分離失敗。

16. 問：制備色譜柱如何測柱效？

答：

可以選擇幾種物質(zhì)，苯，甲苯，萘、蒽等的衍生物上柱，流動相一般用65-80%的甲醇/水，測定后根據(jù)保留時間計算塔板數(shù)。由于制備色譜的管路死體積一般比較大，很難得到和供應(yīng)商相同的柱效。建議在制備柱開始使用時在自己的色譜上測一下柱效，然后定期檢測柱效進(jìn)行以進(jìn)行比較。

17. 問：反相色譜分離后，如何快速從流動相中得到產(chǎn)品？

答：

可以考慮先在低溫下，減壓旋蒸除去其中的有機溶劑，然后用萃取的方法（如，乙醚、氯仿萃取等）把產(chǎn)品萃取出來，然后再低溫再旋蒸，這樣，就可以不將溫度升得很高而得到產(chǎn)品。如果要直接蒸掉流動相，水泵的真空度要注意（要檢查氣密性），否則蒸水會很慢。一般比較好的泵在60～70度即可蒸掉水，如果泵的真空度不好，可能需要80～90度才行，這樣容易暴沸導(dǎo)致樣品損失。溫度太高可能引起物質(zhì)變性。

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