寫在前面

同樣是做熒光定量 PCR 實驗，用了文獻里的方法，照搬了人家的引物，為什么結(jié)果總是不太一樣？

同樣是做熒光定量 PCR 實驗，用了文獻里的方法，照搬了人家的引物，為什么結(jié)果總是不太一樣？

我們往往謹慎對待：引物、探針、Ct 值等，但也有一些小東西會被忽視，比如：ROX?。也許很多同學的第一反應是：總聽人說起 ROX?，但它是什么？它在熒

光定量 PCR 里起到什么作用呢？

其實和 FAM?、VIC?、SYBR? Green 類似，ROX? 也是一種在 qPCR 反應中能被 qPCR 儀檢測到的熒光染料分子。但與其他染料不同，ROX? 是一種惰性參比染料，也就是說，其熒光信號并不隨著 PCR 擴增而增強。相反，ROX? 的熒光信號值在反應中是基本保持不變的。

ROX? 有什么用呢？

其實，在 qPCR 反應中有許多反應本身的物理因素會影響信號檢測，從而造成孔間數(shù)據(jù)的差異。例如：PCR 反應板本底信號不均一，PCR 管蓋厚度有差異，同一反應體系在分裝時出現(xiàn)了差異等因素。ROX? 能幫助我們通過均一化校正消除這些因素的誤差，從而提高數(shù)據(jù)精確性。

ROX? 的工作原理：

請大家注意看板上的兩個孔，我們在每個孔中加入「完全等量」的樣本，然后進行擴增。很快，30 個循環(huán)完成了。在每一個循環(huán)中，我們的儀器都會讀取出一個熒光信號值。

理論上儀器檢測出這兩個孔的信號值應該是完全相同的，因為剛開始的時候樣品是完全一樣的。但實際上，由于移液器加樣存在誤差，耗材孔間不同等一系列差異，這兩孔檢測出的信號值并不相同。幸運的是，我們在兩個孔中都加了相同的 ROX?，而我們的儀器也同時讀取了 ROX? 的信號值。

可以看到，ROX? 信號和 qPCR 反應熒光信號都有差異。仔細思考大家會發(fā)現(xiàn)，反應本身的這些物理差異會對 ROX? 信號和 qPCR 反應的熒光信號造成同等程度的影響。

重要的是，我們的儀器會在每一個循環(huán)中檢測每一個反應孔的這兩種信號，然后在反應結(jié)束后自動進行均一化處理。結(jié)合儀器自身的一系列熒光校準參數(shù)，最終您的數(shù)據(jù)精度會得到顯著提高。順便提一下，最終這個值也就是我們所說的 Rn 值，也表示報告基團的標準化熒光值。

兩個關于 ROX? 的重點：

第一，除非有些特殊情況，Applied Biosystems? 提供給您的熒光定量預混液已經(jīng)包含了最佳濃度的 ROX?，因此您無需再額外添加。

第二，所有 Applied Biosystems? 實時熒光定量 PCR 軟件是默認檢測 ROX? 并使用均一化數(shù)據(jù)，這會幫您提高數(shù)據(jù)精確性。如果您選用的試劑盒或者預混液不含 ROX?，依據(jù)您對實驗的精度的要求不同，您可以另外采購 ROX? 摸索最佳濃度優(yōu)化實驗，您也可以將參比熒光染料選項改為 None（無），放棄 ROX 校正。在沒有 ROX? 存在的情況下，我們建議選擇參比熒光為 None 進行數(shù)據(jù)分析。