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干貨:分子生物學常見問題解答

文字:[大][中][小] 手機頁面二維碼 2017/11/15     瀏覽次數:    

分子生物學(molecularbiology)是從分子水平研究生物大分子的結構與功能從而闡明生命現象本質的科學。自20世紀50年代以來,分子生物學是生物學的前沿與生長點,其主要研究領域包括蛋白質體系、蛋白質—核酸體系(中心是分子遺傳學)和蛋白質-脂質體系(即,生物膜)。1953年沃森、克里克提出DNA分子的雙螺旋結構模型是分子生物學誕生的標志。


科普完畢,現在開始畫重點嘍!

1.基因組 DNA 的得率較低或者無基因組 DNA 原因,如何解決?

1 ) 樣品材料老化或者反復凍融導致 DNA 含量下降:

應選擇新鮮的材料樣品,如新鮮血液、新鮮菌液、剛離體的動物組織或幼嫩的植物組織等,不能立即處理的樣品應放入液氮或-70℃低溫保存,以免DNA降解。

2 ) 樣品破壁或者裂解不完全, DNA 未充分釋放:

動植物樣品應在液氮中充分研磨,G+細菌、酵母等破壁較困難的樣品應用溶菌酶、Lyticase酶或機械方法協助破壁。

3 ) 樣品過多導致細胞裂解不充分:

加樣過多導致細胞裂解不充分,細胞裂解不充分。

4 ) DNA 吸附不均勻:

如,在上吸附柱前沒有加無水乙醇,或使用低濃度乙醇代替無水乙醇,會導致DNA不能充分沉淀,與硅膠模吸附不徹底,因此應在樣品裂解后加適量的無水乙醇,再上吸附柱使DNA與硅膠模充分吸附。

5 ) DNA 洗脫不適當:

洗脫緩沖液pH過低會阻礙DNA從硅膠模上洗脫下來,應確保洗脫液pH值在7.0~8.5之間。洗脫液體積過少(<30μL),不易浸透硅膠模,使DNA不能洗脫下來,因此,洗脫液體積應大于30μL,超過200μL,所得的DNA 濃度降低。洗脫時可以將洗脫液于65~70℃水浴預熱,加入洗脫液后在室溫靜置2~5分鐘,可提高洗脫效率,加大DNA 產量。

2.基因組 DNA 質量測定的問題分析 :

采用分光分度測定時OD260/OD280 比值1.8,說明大量RNA 殘留,沒有使用RNase A,或RNase A活性下降。

3.提取的基因組 DNA 有降解,如何解決?

選取的材料不新鮮或反復凍融,采集材料后未及時處理或未低溫保存:陳舊血液或不新鮮的材料中,細胞凋亡導致DNA降解,或者低溫保存的樣品經反復凍融導致細胞破碎,內源性核酸酶降解DNA,因此應該選用新鮮的材料樣品,不能及時處理則低溫保存,運輸過程中應該使用干冰:

1 ) 未能有效的抑制內源性核酸酶的作用:

某些DNase含量豐富的動植物組織樣品應在液氮中研磨或勻漿,研磨過稱中隨時補充液氮,并在樣品未完全解凍之前加入含有抑制核酸酶作用的裂解液。

2 ) 操作過于劇烈導致 DNA 被機械打斷:

預處理的樣品應該加入細胞裂解以后,所有操作應該盡量柔和,避免劇烈振蕩。

4.提取的基因組 DNA 不能順利的進行后繼實驗,如何解決?

得到的基因組在進行常規下游實驗如PCR、酶切、分子雜交等生物學實驗時如不能順利進行,主要原因為DNA 樣品不純,含有蛋白、有機溶劑和鹽類等雜質影響內切酶或DNA 聚合酶的活性:

1 ) 樣品過多導致細胞裂解不充分:裂解液不能有效與樣品混合,導致裂解不徹底,殘留大量蛋白、多糖、脂類等雜質,為后繼的上吸附柱分離純化造成影響。

2 ) DNA 洗脫前,有大量乙醇殘留:有機溶劑乙醇可嚴重的抑制內切酶、DNA聚合酶的活性,而在DNA過柱洗滌過程中均使用含有乙醇的去蛋白液和漂洗液,因此在洗脫 DNA前,一定要充分去除殘留的乙醇,再加洗脫液。

5.提取的基因組 DNA 有 RNA 污染,如何解決?

得到的基因組在進行常規下游實驗如,PCR、酶切、分子雜交等生物學實驗時如不能順利進行,主要因為DNA 樣品不純,含有蛋白、有機溶劑和鹽類等雜質影響內切酶或DNA 聚合酶的活性。

1)實驗過程中沒有有效使用RNase A,應嚴格按照實驗要求進行。

2)RNase A失活:RNase A應該于-20℃下保存,低溫保存時RNase A比較穩定,不易失活,但是,反復凍融會影響其活性。

6 . 未提出質粒或質粒得率較低原因?

1 ) 大腸桿菌老化:

請涂布平板培養后,重新挑選新菌落進行液體培養。

2 ) 質粒拷貝數低:

由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA 提取量低,可更換具有相同功能的高拷貝數載體 。

3 ) 菌體中無質粒:

有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在,經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如,柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定,因此,不要頻繁轉接,每次接種時應接種單菌落,另外,檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4 ) 堿裂解不充分:

使用過多菌體培養液,會導致菌體裂解不充分。

5 ) 吸附柱過載:

不同產品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的質粒量很大,請分多次提取。

6 ) 質粒未全部溶解(尤其質粒較大時):

洗脫溶解質粒時,可適當加溫或延長溶解時間。

7 ) 乙醇殘留:

漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體,樹脂型試劑盒漂洗后應晾干樹脂,再加入洗脫緩沖液。

8 ) 洗脫液加入位置不正確:

洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。

9 ) 洗脫液不合適:

DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫,如,洗脫緩沖液EB(10mM Tris?Cl,pH8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH7.0~8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內,如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用有利于提高洗脫效率。

7.質粒純度不高的原因?

1 ) 混有蛋白:

不要使用過多菌體。溶液P1、P2、P3 處理并離心后溶液應為澄清的,如果還混有微小蛋白懸浮物,可再次離心去除后再進行下一步驟。

2 ) 混有 RNA :

RNase A處理不徹底,請減少菌體用量或加入溶液P3之后室溫放置一段時間。如果溶液P1已保存6 個月以上,請在溶液P1中添加RNase A。

3 ) 混有基因組 DNA :

加入溶液P2和P3后應溫和混勻,如果劇烈振蕩,可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質粒中。如果加入溶液P2后過于粘稠,無法溫和混勻,請減少菌體用量。細菌培養時間過長會導致細胞和DNA的降解,不要超過16h。

4 ) 質粒的二聚體和多聚體形式:

質粒復制過程中形成的,與宿主菌相關,電泳可檢測出。

8.DNA 在上樣電泳時溢出點樣孔,如何解決?

質粒DNA產物中殘留酒精;漂洗液洗滌后應盡量除去結合柱中殘留液體,適當晾干吸附柱。

9.RNA 提取時 RNA 降解原因?

1 ) 新鮮細胞:

裂解液的量不足,使得裂解不充分。

2 ) 新鮮組織:

某些含有內源性核酸酶的樣品,很難避免RNA酶的降解,建議采用的方法為在液氮條件下將組織研碎,并且,勻漿時采用更多的裂解液。

3 ) 冷凍樣品:

樣品取材后應該迅速置于液氮中冷凍存放,然后轉移到-70℃冰箱存放。如果未經液氮速冷直接轉移到-70℃冰箱存放,會造成RNA緩慢降解。樣品研磨后,在液氮剛剛揮發完時,將樣品迅速轉移到含裂解液的容器中,立即混勻勻漿。

4 ) 外源 RNA 酶的污染:

試劑、器械等實驗用品應該采用DEPC 水滅菌處理。

5 ) 內源 RNA 酶的污染:

抑制劑失效或者用量不夠,實驗樣品過多或者勻漿溫度過高。

10 . OD260/OD280 比值偏低原因?

1 ) 蛋白質污染:

確保不要吸入中間層以及有機相;減少樣品起始量,確保裂解完全。加入氯仿后會充分混勻,離心的轉速和時間要合適,如果一次抽提不徹底,可使用氯仿重新抽提一次。

2 ) 多糖或多酚殘留:

一些特殊的組織和植物中,多糖和多酚含量較多,會導致OD260/OD280比值偏低。

3 ) 測定方式的差異:

測定OD260以及OD280數值時,要使OD260讀數于0.1~0.5之間,此曲線線性范圍最好;用水稀釋樣品,測定的比值要比TE稀釋的比值偏低。

11 . RNA 提取得率偏低原因?

1 ) 組織或細胞中 RNA 含量偏低:

不同細胞或者組織中RNA的豐度不一樣,RNA提取量也不一致。

2 ) 樣品起始量太少或者太多:

樣品起始量太少,則細胞組織中RNA含量較低,樣品過多則超過裂解液的裂解能力,使得裂解不完全,從而RNA得率低。

12 . PCR 反應出現假陰性結果,無擴增條帶原因?

PCR 反應的關鍵環節有 :

① 模板核酸的制備;

② 引物的質量與特異性;

③ 酶的質量;

④ PCR循環條件;

尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究 , 可能出現的原因有以下幾點:

1 ) 模板:

① 模板中含有雜蛋白質;

② 模板中含有Taq酶抑制劑;

③ 模板中蛋白質沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白;

④ 在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚;

⑤ 模板核酸變性不徹底。

※ 在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩定的消化處理液,其程序亦應固定不宜隨意更改。

2 ) 酶失活:

需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

3 ) 引物:

引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是 PCR 失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:

① 選定一個好的引物合成單位;

② 引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如,一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決,如,一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度;

③ 引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。

④ 引物設計不合理,如,引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。

4 ) Mg 2+ 濃度:

Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

5 ) 反應體積的改變:

通常進行PCR擴增采用的體積為20μL、30μL、50μL。或100μL,應用多大體積進行PCR 擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如,20μL后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。

6 ) 物理原因:

變性對PCR 擴增來說相當重要,如,變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。

7 ) 靶序列變異:

如,靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。

13 . PCR 反應出現假陽性結果原因?

1 ) 引物設計不合適:

選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而,在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。需重新設計引物。

2 ) 靶序列或擴增產物的交叉污染:

這種污染有兩種原因:

一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。

二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但,有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補后,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

14 . PCR 反應出現非特異性擴增帶的原因與對策是什么?

PCR 擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。可能出現的原因有以下幾點:

1)引物與靶序列不完全互補或引物聚合形成二聚體;

2)Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低及PCR循環次數過多有關;

3)其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增;

4 ) 其對策有:

必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。

15 . PCR 反應出現片狀拖帶或涂抹帶原因?

1)PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。

2) 其對策有:

①減少酶量,或調換另一來源的酶;

②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量,減少循環次數。

16 . 克隆 PCR 產物的最優條件是什么?

最佳插入片段:

載體比需實驗確定,4:1(插入片段:載體)常為最佳比,摩爾數比1:8 或8:1也行。應測定比值范圍。連接用5μL2X連接液,50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,插入片段共10μL。室溫保溫1h,或4℃過夜。在這2種溫度下,缺T-凸出端的載體會自連,產生藍斑。室溫保溫1h能滿足大多數克隆要求,為提高連接效率,需4℃過夜。

17 . PCR 產物是否需要用凝膠純化?

如,凝膠分析擴增產物只有一條帶,不需要用凝膠純化。如,可見其他雜帶,可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高,這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆,而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

18 . 如果沒有回收到目的片段,還需要作什么對照實驗?

涂布未轉化的感受態細胞: 如有菌落,表明氨芐失效,或污染上帶有氨芐抗型的質粒,或產生氨芐抗型的菌落:

1 ) 轉化完整質粒,計算菌落生長數,測定轉化效率:

例如,將1μg/μL質粒1:100 稀釋,1μL用于100μL感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000μL后,用100μL鋪板。培養過夜,產生1000個菌落。

轉化率為:產生菌落的總數 / 鋪板 DNA 的總量。

2)如用pGEM-T正對照,或PCR產物,產生>20~40藍斑(用指定步驟108cfu/ug感受態細胞),表明載體失去T,可能是連接酶污染了核酸酶。T4DNA連接酶(M1801,M1804,M1794)質量標準好無核酸酶污染,不應用其它來源的T4DNA連接酶替換。

3)用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,連接pGEM-T正對照,轉化高頻率感受態細胞(108cfu/ug),按照指定的實驗步驟,可得100個菌落,其中60%應為白斑,如,產生>20-40藍斑,沒有菌落或少有菌落,連接有問題。

小結

總之,分子生物學的興起是整個自然科學的一件大事,它使整個生命科學的研究上升到一個全新的階段。在實際應用方面,它是生物工程技術的重要理論基礎,后者正在工農業生產和環境保護等方面發揮著日益顯要的作用。醫學作為生命科學的重要組成部分,所受分子生物學的滲透和影響尤其重大。(文章來源:互聯網)


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